Clonage
 

     A partir du bouturage in vitro, on a cherché une méthode permetant d'obtenir un plus grand nombre de plantes. Les milieux C de Knudson, celui de Murashige et Skoog (1962), solidifiés avec 1% d'agar-agar ainsi que le milieu de Vacin & Went (1949) ont été utilisés avec plus ou moins de succés. Les méthodes employées sont très variables. Dans certain cas les bourgeons sont mutilés, soit en les coupant au 2/3 parallélement à la hampe florale puis obliquement, soit en les fendant en 2, soit en les criblant avec une aiguille stérilisée. La première et la troisième méthode donnant les meilleurs résultats. En réaction à ces traitements, les cals produisent de nombreux bourgeons. Avec cette méthode encore, les quantités de plantes obtenues ne sont pas très importantes et des difficultés considérables ont été rencontrées pour une multiplication de masse. Ces difficultés sont maintenant résolues par de nombreux laboratoires.
    
Un des problèmes majeurs est la production par les explants de composés phénoliques toxiques pour les tissus eux-mêmes.Les tissus des Phalaenopsis ont une concentration élevée en composés phénoliques. Les méristémes excisés noircissent rapidement, des produits oxydants de ces phénols diffusent dans le milieu et la plupart des explants meurent. Plusieurs produits ont été utilisés pour lutter contre ce phénomène, mais le procédé le plus efficace consiste à transférer fréquemment les explants sur des milieux frais (chaque 2 à 3 semaines).
    
Un protocorme donne 4 à 20 protocormes tous les 25/35 jours.
    
Plusieurs méthodes sont utilisées. Il est possible de partir d'échantillons prélevés sur les hampes florales, ou sur des feuilles de plantes cultivées in-vitro où in-vivo.
    
La multiplication extensive des tissus est cause de mutations.Certains clones produits in-vitro ne sont donc pas des reproductions parfaites de la plante originale. La concentration élevée d'hormones dans les milieux de culture peut provoquer des changements de couleurs, de formes et de dimensions des fleurs,ainsi que des malformations diverses sur les plantes. Pour prévenir ces problèmes, la meilleure méthode consiste à ne pas chercher à "sur multiplier" à partir d'un seul prélévement, mais au contraire, à ne produire que des petites séries. L'origine génétique des plantes à multiplier joue à ce sujet un grand rôle.

 

     Le milieu C de Knudson reste celui qui donne le plus de satisfactions. Il est additionné de différentes substances dont l'action n'est pas toujours comprise. Ainsi, le lait de coco induit la prolifération de protocormes, et la banane sous forme de farine ou fraiche a une action positive sans que l'on sache exactement pourquoi.
    
La croissance des protocormes est bonne sur milieu Hyponex avec 2% de pomme de terre, 2,5% de banane, 0,01% d'acide citrique, 0,6% de tryptone, 2% de sucrose, 0,8% d'agar et 0,1% de charbon de bois.
    
La Peptone est une source d'azote pour la culture d'organismes in-vitro. C'est un composé riche en acides aminés qui ont une action positive sur la végétation. Lami (1927) prouve que les peptones améliorent la germination des Phalaenopsis, avec des doses de 1 à 2%.

 
Pour voir une possibilité schématique de multiplication clonale, cliquez ici.
 
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