Noël Bernard n'a jamais obtenu de forme fructifère parfaite de ces différents champignons. Il a pensé que dans les serres à orchidées ils se maintenaient sous leur forme stérile. Il émettait toutefois l'hypothèse que les formes parfaites pourraient être trouvées un jour ou l'autre.
     Le Dr Burgeff classe les champignons endophytes dans la tribu des Ascomycétes. Il juge quant à lui qu'il y a au moins 6 groupes de champignons qui peuvent intervenir.
     Noël Bernard espérait aussi que l'emploi de Rhizoctonia d'un groupe au contact de graines ne se rapportant pas à ce groupe aurait pour effets d'obtenir des plantes hybrides différentes de celles obtenues de mêmes graines contaminées par le champignon se rapportant à leur genre. C'était bien sur une erreur et dès 1914 on s'en aperçut.

     On notera un désaccord entre Noël Bernard et Burgeff à ce sujet, sans doute dû à la nature des milieux de culture employés. Burgeff utilise des milieux moins riches en hydrate de carbone alors que Noël Bernard avec des milieux plus chargés obtient un feutrage d'amas mycélien qui, très virulent, enveloppe et détruit les graines au cours des premières semaines.
     Un champignon isolé en novembre 1904 s'est révélé actif en août 1905, mais un an plus tard il était complètement dégénéré.

Elle se divise en 4 parties.

     -La préparation des milieux de culture artificiels ou naturels. Par milieux artificiels nous entendons les solutions organiques ou minérales, liquides ou solides, préparées d'après la méthode pasteurienne ; par milieux naturels, ceux composés de matériaux ordinairement employés en horticulture : Sphagnum, fibre, osmonde, couar*, etc...
     -Isolement du champignon endophyte.
     -Récolte aseptique des graines.
     -Semis et repiquage des jeunes plantules.
   * couar = fibre de coco..

     On n'en conserve que la partie liquide qui subit une nouvelle stérilisation et peut ainsi être conservée jusqu'à son emploi. A ce moment, elle est versée dans les récipients de culture munis d'une petite plaque de coton hydrophile et stérilisée de nouveau.
     Pour les préparations solides, il ne faut pas séparer après macération la partie liquide de la partie solide, on y ajoute 10 pour mille d'agar-agar et l'on chauffe à l'autoclave à 120°. Aussitôt sortie, cette préparation, encore chaude, est versée directement dans les récipients destinés à recevoir les semences, et après stérilisation, les tubes ou flacons sont placés dans une position inclinée.
     Burgeff employait de préférence les solutions minérales et surtout le liquide A de Meyer dont la composition est la suivante :

     Il ajoutait au moment de la cuisson une dose d'amidon variant avec les cultures auxquelles les préparations étaient destinées. Par exemple 0,5 gr pour les cultures pures de Rhizoctonia de Cattleya et 5 gr pour les autres genres.
     La préparation de ce mélange se faisait de la manière suivante. On faisait dissoudre à froid pendant 24 heures les produits composant le liquide A de Meyer et la dose d'agar-agar portée à 15 pour mille, puis, dans un récipient émaillé ou en terre cuite, l'on procédait à la cuisson menée jusqu'à ébullition et continuée à petit feu pendant quarante minutes environ. En cours d'opération, l'on ajoutait la dose d'amidon jugée nécessaire et l'on neutralisait, s'il y avait lieu, avec du carbonate de potasse. Le mélange bouillant était versé dans les récipients de culture, puis stérilisé à l'autoclave.
     Pour obtenir une surface rugueuse on étendait sur le dessus après refroidissement une légère couche d'osmonde hachée menue et préalablement passée à l'étuve. Une nouvelle stérilisation s'imposait, mais cette fois dans un jet de vapeur d'une durée de 20 minutes.
     Cette manipulation laborieuse a été par la suite simplifiée avec une seule stérilisation.
     On peut ajouter à la surface des milieux ainsi préparés des fragments de racines provenant de plantes du même groupe que celles d'où sont issues les graines à semer, avec l'espoir de voir celles-ci contaminer le milieu. Néanmoins, les résultats sont plus surs en utilisant des rhizoctonia cultivés in-vitro.
     La contamination est infiniment plus certaine, la germination plus assurée si on inocule quelques jours avant d'y répartir les semences, les composts destinés à recevoir celles-ci. Ainsi préparé, ce compost est déjà envahi par le mycélium qui, de suite, prend possession des graines et en favorise la germination.
     Un procédé très pratique imaginé par Burgeff consiste à infester longtemps à l'avance un substratum tout préparé que l'on a toujours sous la main au moment désiré. Il se sert principalement de sphagnum et de fibres de polypode, ou mieux, de sphagnum et d'osmonde hachée ; ces milieux étant acides de leur naturel et cette acidité s'accroissant en cours d'ébullition, ne devront être bouillis que peu de temps dans de l'eau de pluie, ils seront ensuite pressurés pour en extraire l'eau en suspend, et lavés dans de l'eau de pluie bouillie et refroidie. Cette eau est également éliminée en partie tout en laissant cependant la masse suffisamment imprégnée. Des flacons très propres sont emplis de ce mélange, ils sont fermés avec un bouchon de coton cardé et stérilisés pendant une demi-heure environ à 100°c pour supprimer les champignons parasites et leurs spores.
     Après refroidissement, il est procédé à l'inoculation en prélevant à partir des tubes renfermant des cultures pures à l'aide d'instruments propres et flambés, des fragments assez gros de gélose infestée.
     Ces flacons ainsi préparés, bien fermés, sont conservés dans un local sain à une température modérée. Peu à peu, à la loupe, ou même à l'oeil nu, on peut voir les filaments mycéliens envahir le milieu et se développer presque sur les parois du verre. Trois ou quatre semaines après, ce substratum peut être employé pour les semis de graines. Il suffit d'en prendre une partie que l'on place dans des pots ou de préférence dans des récipients en verre pouvant se fermer, puis on y répartit les graines à la surface même ou sur une toile recouvrant celle-ci. Ce procédé donna entière satisfaction jusqu'en 1908 avant la mise en pratique des semis en tubes aseptiques.
     M le Dr Gratiot estime que l'influence du rhizoctonia joue un grand rôle dans la végétation des plantes adultes. Il obtint des sujets de grande vigueur, notamment sur le Vanda en continuant à inoculer avec les champignons virulents convenant à leur genre, le compost dans lequel ces plantes étaient cultivées. Mais ce champignon qui n'est indispensable que dans les cultures en tube l'est-il plus pour amener vigoureusement les plantes à l'âge adulte et ne pourrait-on pas, comme pour les germinations asymbiotiques, le remplacer par un équivalent. Le sucre, sous quelque forme qu'on l'emploie, étant dans ces cultures l'élément sans lequel les graines restent inertes : Il y a lieu de penser qu'en l'employant sous une autre forme plus appropriée aux plantes cultivées en pots, il pourrait jouer là aussi le même rôle que le champignon. La canne à sucre, le sorgho, l'écorce et les feuilles d'érables récoltés en sève, hachés et séchés, la betterave, la carotte, et tant d'autres, amenés en petits granules presque à l'état de farine entreraient dans une proportion à déterminer dans le compost ordinairement employé et en l'enrichissant provoqueraient peut-être cette végétation luxuriante constatée par le Dr Gratiot.

     Cette opération est la plus importante et la plus délicate de celles que nécessitent les cultures symbiotiques.
     Notons que l'isolement du champignon est plus délicat chez les orchidées tropicales que chez nos orchidées indigènes. L'infestation étant moins régulière dans les racines des premières. On ne la trouve que dans les parties jeunes des racines, mais jamais cependant à leur extrême pointe, alors que les parties arrières ne recèlent que des masses amorphes n'ayant plus aucun pouvoir. Chez nos orchidées indigènes, on trouve des hyphes encore vivantes dans les parties anciennes. Il faut choisir des racines en plein compost, jamais celles qui sont aériennes ou qui sont adhérentes aux parois extérieures des vases de culture. Il faut débarrasser les racines de toutes les impuretés qui y adhérent, puis les laver au pinceau dans une eau savonneuse, les rincer plusieurs fois dans de l'eau stérilisée, et les placer ensuite sur du papier buvard également stérilisé.
     Pour l'isolement du champignon, Noël Bernard se servait d'un microscope redresseur, permettant de pouvoir, sous l'objectif, disséquer facilement une coupe de racine ou une jeune plantule placée sur une lame de verre propre et flambée, sur laquelle était déposée une goutte de décoction de salep stérile. A l'aide d'aiguilles flambées, la racine était disséquée, les pelotons mycéliens détachés des cellules flottaient alors dans le liquide ; les meilleurs étaient choisis et prélevés à l'aide d'un fil de platine flambé et aussitôt placés dans des tubes à essais renfermant le milieu de culture préparé à cet effet. Noël Bernard conseillait d'isoler non pas un seul peloton, mais une plage infestée contenant plusieurs pelotons. Il ajoutait qu'en opérant ainsi, on courrait plus de risques d'avoir une culture rendue impure par les bactéries, mais qu'il était facile d'isoler le champignon à l'état pur quand il avait franchi les colonies bactériennes.
     Burgeff se servait d'un microscope de laboratoire ; il humectait une lame préalablement flambée, d'une goutte d'eau stérilisée, puis, avec un rasoir bien nettoyé et passé vivement à la flamme, pratiquait des coupes longitudinales dans les fragments de racines et examinait celles-ci dans la goutte d'eau sous la lumière de l'objectif du microscope. Le champignon cherché étant trouvé, l'épiderme de la racine était vivement arraché et ensuite plusieurs cellules contaminées étaient prélevées et transportées immédiatement dans des boites de Pétri, en les poussant sur la surface de la gelée. Après quelques jours, 10 à 15, on prélevait des fragments de gélose infectés avec une aiguille flambée pour inoculer d'autres récipients.
     Dans la pratique, les semeurs procèdent de manière plus simple, moins scientifique, mais plus astucieuse. Les coupes de racines sont colorées au besoin au bleu lactique pour découvrir plus facilement le champignon, celui-ci repéré, on le prélève directement et on transporte les pelotes recueillies dans les tubes prêts à les recevoir. La rapidité de la dissection assure seule les risques d'infections ultérieures.
     Le champignon peut aussi s'obtenir de jeunes plantules sans avoir recours à la dissection ; celles qui sont septiques sont désinfectées comme il sera indiqué plus loin pour la désinfection des graines impures, les autres, prélevées des tubes aseptiques, sont placées dans des récipients préparés pour recevoir les champignons isolés.
     Après quelques jours, 5 ou 6, si aucune moisissure étrangère ne se présente, ces petites plantules sont écrasées sur le milieu ou elles sont placées et le champignon, quand le choix est bien fait et l'opération bien conduite, s'échappe pour contaminer le milieu, donnant ainsi de lavis de Noël Bernard, un champignon régénéré.

     Des graines de bonne qualité sont indispensables pour obtenir une germination régulière. Une étude au microscope ou avec une bonne loupe permet de se rendre compte de la qualité de celles-ci.
     On préférera celles qui forment une sorte de proéminence à leur partie centrale.
     Pour les cultures aseptiques, les fruits ou les gousses et les graines doivent être récoltés aseptiquement, sous peine de voir les substratums sur lesquels elles sont réparties, envahis par des moisissures étrangères.
     Rien n'est plus facile que de récolter aseptiquement les graines d'orchidées, et cependant, ce procédé, si simple soit-il, est généralement peu en faveur chez les praticiens qui paraissent préférer récolter leurs semences sans aucune précaution, quitte par la suite, à les désinfecter à l'aide de solutions de sublimé, d'hypochlorite de calcium, d'eau oxygénée, etc...
     Avec un peu de pratique, on discerne facilement le moment où le fruit peut-être détaché de la plante qui le porte, ce qui se produit un peu après que le fruit jaunit et se ride à l'extrémité.
     Le fruit détaché, transporté dans un local sain, est trempé ou badigeonné d'alcool et flambé au-dessus d'une lampe à alcool, puis, à l'aide d'instruments propres et flambés, on procède à l'extraction des graines qui sont reçues dans des boites stériles immédiatement refermées. En les plaçant dans un local sain, à température moyenne, on peut différer le semis sans crainte.
     Pour désinfecter des graines impures, on utilise une solution de sublimé au millième dans de l'eau distillée stérile et un tube de verre ouvert aux deux extrémités. A l'une d'elle est fixée une gaze légère sur laquelle sont posées les graines qui peuvent être ainsi plongées dans le désinfectant et retirées très facilement. A la sortie de ce bain qui dure 5 minutes, elles sont, avec le tube qui les contient, agitées pendant plusieurs minutes dans de l'eau distillée stérile renouvelée plusieurs fois, puis rincées afin qu'il ne reste plus trace de sublimé.

     En possession de bonnes graines récoltées aseptiques ou désinfectées, de tubes de cultures pures de champignon et de récipients avec substratum préparés pour recevoir les semences, l'on procède à la répartition de celles-ci en se servant de petits instruments bien propres et flambés aussi souvent que cela parait nécessaire.
     Les tubes ou flacons sont débouchés isolément ; Leur ouverture est présentée à la flamme avant l'introduction des semences qui sont alors réparties aussi régulièrement que possible.
     Quand il s'agit de cultures symbiotiques, le champignon endophyte peut, s'il n'y est déjà, être inoculé aussitôt, mais il est préférable d'attendre 4 ou 5 jours afin de se rendre compte si les graines, bien que récoltées aseptiquement, n'ont pas apporté avec elles de moisissures étrangères. Aprés cette constatation on procède à l'inoculation du champignon endophyte en se servant d'une petite pelle ou d'une aiguille en platine dont on a aplati la pointe, et flambée. Le tube contenant une culture pure de rhizoctonia est débouché, et après avoir passé l'ouverture dans la flamme on prélève un petit morceau de gélose infesté que l'on transporte aussi vivement que possible dans le récipient contenant les graines semées. Ces récipients sont chaque fois, avant et après chaque opération, flambés et rebouchés immédiatement. A la dernière opération, un petit morceau de coton cardé est légèrement brûlé et enfoncé de telle sorte qu'il reste environ 1 cm d'intervalle entre ce bouchon et un autre coton hydrophile imprégné de solution de sublimé à 1 pour mille qui complète la fermeture et vient diminuer les risques toujours grands de contamination extérieure.
     Ainsi préparées, les cultures peuvent être placées dans le milieu chaud et humide qui leur convient. Ces diverses opérations doivent être effectuées dans un local sain.
     Le repiquage des jeunes sphérules en milieu stérile peut-être différé si les milieux sont restés indemnes de contaminations extérieures, l'on constate, en effet, que la végétation, dès leur jeune âge, est plus grande chez les plantes enfermées dans leur prison de verre que chez celles de même provenance repiquées en pots, mais lorsqu'elles sont infectées, la seule chance de les sauver est de les repiquer immédiatement sur substratum ordinaire. Ces moisissures qui nuisent aux jeunes germinations ne paraissent pas faire souffrir les petites plantes portant quelques feuilles.
     Ce repiquage différé jusqu'à ce que les plantes portent plusieurs feuilles est fait, soit en récipient fermé, soit en pots ou en terrines.
     Il y a parfois avantage à repiquer plus tôt les jeunes sphérules, c'est lorsque celles-ci ont été élevées dans des milieux très concentrés, qui sont indispensable pour provoquer les germinations asymbiotiques, mais deviendraient nuisibles par la suite. Des jeunes sphérules de Phalaenopsis seront repiquées sur des milieux plus dilués, telle la solution de Meyer, gélosée et additionnée de 1,5 gr à 2 gr pour mille d'amidon.

     Il faut utiliser des milieux riches. Le saccharose, le glucose, ou de préférence le fructose, paraissent indispensables. La peptone joue également son rôle employée à faible dose.
     M Knudson indique la composition suivante :

    Le premier article de Knudson concernant la multiplication asymbiotique des orchidées parut en 1921 dans le bulletin de la Société Royale d'Histoire naturelle d'Espagne, pendant un séjour d'étude de deux ans qu'il effectuait en Europe, partageant son temps entre l'Espagne et la France. Ses premiers essais concernaient des semis d'Epidendrum, de Cattleya et de Laelia en utilisant le milieu de Pfeffer et une modification de celui-ci, le milieu "B" de Knudson.
     A peu près ignoré du monde scientifique, ce premier rapport fut suivi en 1922 d'un second article, beaucoup plus développé dans une parution aux Etats-Unis, "Botanical Gazette volume 73", qui reçut un accueil beaucoup plus favorable.
     Dans le même temps, l'Orchid Review publie plusieurs articles relatant les expériences faites par Knudson. On y donne la constitution des bouillons de culture et le procédé employé pour la désinfection des semences impures.
     Les premières expériences de Knudson remontent précisément au 14 janvier 1919 avec un semis de Cattleya mossiae effectué sur du milieu de Pfeffer. Au premier juillet 1919, les semis laissaient déjà apparaître leurs premières feuilles. Le 18 juillet 1919, il semait des graines d'un hybride entre le Cattleya intermedia et le Cattleya Lawrenceana sur son milieu "B" additionné de 2% de glucose et sur le même milieu additionné de 2% de sucrose. En juin 1920 tous les semis étaient bien développés. Il en concluait que la germination pouvait être indépendante de l'action de tout champignon.
     Il poursuivit ses expérimentations et effectua son premier semis de Phalaenopsis en 1925 (Phalaenopsis Schilleriana).
     La méthode de Knudson fut très contestée à ces débuts. Un mycologiste du British Museum alla même jusqu'à comparer une germination d'orchidée sans champignon à un Hamlet sans Prince du Danemark. En France, Costantin, maître de Noël Bernard, et Magrou, cousin de ce dernier, perçurent les travaux de Knudson comme une attaque contre les travaux concernant les semis symbiotiques. Costantin prétendit que les semis de Knudson ne pourraient jamais fleurir et que l'absence de symbiose léserait la croissance de la plante. Puis, devant l'apparition des premières fleurs, il affirma que celles-ci ne fleurissaient que parce que les plantes avaient été envahies pendant leur vie d'adulte.